RT-qPCR
实验原理：
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time polymerase chain reaction）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。它结合了PCR技术和实时荧光检测技术，能够在PCR反应过程中实时监测DNA的扩增情况 ，从而实现对靶DNA的定量分析。
实验步骤
简述流程：RNA 提取 → 反转录 → 设计引物 →qPCR
1.实验器材及试剂准备：
准备多样品研磨珠均质仪、台式高速冷冻型微量离心机、荧光定量PCR仪等设备。
2.准备Trizol试剂、PCR反应体系等试剂。
3.样品RNA提取：取100mg组织，加入1ml的Trizol Reagent，充分研磨后离心，取上清液。
4.cDNA合成：配制反转录反应体系，合成cDNA。
5.定量PCR反应：在0.2ml PCR管中，配制反应体系，加入引物和cDNA，进行PCR扩增。
6.结果分析：使用ΔΔCT法进行结果处理，计算目标基因的表达量。 这些步骤为荧光定量PCR实验的基本流程，确保每一步都严格按照实验要求进行。
注意事项：
- 1.所有步骤均应在超净工作台上进行，超净台紫外照射至少15min。
- 2.所有试剂应为此实验专用。
- 3.使用75％乙醇或其他去污剂擦拭工作台，避免表面污染。
- 4.进入荧光定量PCR 操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR 模板污染。
- 5.实验中使用各种规格的离心管，枪头及配制试剂和溶解沉淀用的水，均应焦碳酸二乙酯（DEPC）处理后使用，以去除吸附的RNA酶污染。
- 6.使用Trizol试剂时，避免接触皮肤或衣服。避免吸入蒸气。
- 7.qPCR反应需要qPCR级水，试剂和试管。请务必使用正确类型的qPCR光学PCR管和盖子。不可用普通的PCR管。
- 8. 加样前，先布局，规划加样顺序以避免交叉污染。
- 9.所有实验应均应设置无模板对照，其中包含除DNA或cDNA样品以外的所有反应组分。
- 10.先配制qPCR反应混合液，减少误差。
- 荧光定量PCR服务：
产品说明书：/usr/uploads/3/202509/GA-Poly A miRNA qRT-PCR Detection Kit 使用说明_1.pdf /usr/uploads/3/202509/GA-Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Detection Kit 使用说明_1.pdf /usr/uploads/3/202509/基安加尾法miRNA qPCR引物说明书~100umol版本-50~已审核_pagenumber_organized.pdf
