CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9系统是一种强大的基因编辑工具，主要用于基因敲除和基因敲入，操作步骤包括设计gRNA、导入Cas9酶和进行DNA修复。广泛应用与生物技术以及医学领域。
原理：
1.靶向识别：gRNA与目标DNA序列互补配对，确保Cas9蛋白能够准确识别目标位置。目标DNA序列的3'端需要有特定的PAM序列（通常为5'-NGG-3'），这是Cas9蛋白识别和切割的关键。
2.DNA切割：Cas9蛋白在gRNA的引导下，切割目标DNA，产生双链断裂（DSB）。这一过程是基因编辑的基础，细胞会启动修复机制来修复这些断裂。
3.DNA修复：细胞修复双链断裂的方式主要有两种：
（1）NHEJ（非同源末端连接）DNA修复途径，该途径容易出错并在DSB位点产生插入/缺失（Indels），导致移码或提前终止密码子；
（2）HDR（同源定向修复）途径，该途径寻找同源DNA序列，并在找到一个后引发同源重组，且错误率较低。由于Cas9作为通用内切酶发挥作用，唯一需要的是gRNA，它可以化学合成、体外转录或细胞内表达以提供特异性（图1）〔1〕。
图1 CRISPR-Cas9 system原理图〔2〕
CRISPR-Cas9基因编辑技术主要有两种应用方式：
1. 基因敲除（Knockout）：通过CRISPR-Cas9在目标基因上引入双链断裂（DSB），细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复机制修复断裂，过程中可能引入插入或缺失（indels）突变，导致目标基因功能丧失。
2. 基因插入或替换（Knockin）：利用同源重组（HDR）机制，在目标基因上引入特定的突变或外源序列。这需要提供一个含有所需改变的同源模板DNA，细胞利用该模板通过HDR修复DSB，实现精确的基因编辑〔3〕。
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参考文献
1.CRISPR-Cas9 system: A new-fangled dawn in gene editing. Life Sciences, 2019, 232: 116636
2..Das J, Bhatia P, Singh A. CRISP Points on Establishing CRISPR-Cas9 In Vitro Culture Experiments in a Resource Constraint Haematology Oncology Research Lab. Indian J Hematol Blood Transfus, 2019, 35(2): 208～214
3.Ma Y, Zhang L, Huang X. Genome modification by CRISPR/Cas9. FEBS J, 2014, 281(23): 5186～5193
